干細胞表面標志CD133在肝癌中的表達及其陽性亞群增殖特性 

張寶芹(北京大學濱海醫(yī)院、天津市第五中心醫(yī)院消化科，天津市 300450)

引用本文：張寶芹. 干細胞表面標志 CD133 在肝癌中的表達及其陽性亞群增殖特性[J].中國組織工程研究，2017，21(9):1319-1323. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.002 ORCID: 0000-0002-5015-9381(張寶芹) 

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文題釋義：
CD133：是一種重要的表面標志物，具有*的信號傳遞通路，可參與到淋巴細胞再循環(huán)過程中，與腫瘤細胞之間存在十分密切的聯(lián)系。以 CD133 為標志物，利用其蛋白特異性特征可對不同腫瘤干細胞進行分選和研究。此次實驗中，即以 CD133 為標志物對人肝癌 MHCC97-H 細胞株進行培養(yǎng)和分選，獲得 CD133+/CD133-MHCC97-H 細胞。
Notch 信號途徑：是一種細胞間相互作用的基本途徑，調(diào)控著細胞增殖、分化、凋亡等過程。在 Notch 途徑被激活時，干細胞發(fā)生增殖，活性受到抑制時，干細胞開始發(fā)生分化。
摘要
背景：以 CD133 為標志物，利用其蛋白特異性特征可對不同的腫瘤干細胞進行分選和研究。
目的：探討干細胞表面標志 CD133 在肝癌中的表達及其陽性亞群的體外增殖特性。
方法：對人肝癌 MHCC97-H 細胞株進行培養(yǎng)和分選，分別獲得 CD133+與 CD133-
MHCC97-H 細胞，檢測CD133 表達及細胞遷移侵襲能力；培養(yǎng) 14 d，檢測細胞克隆形成率；培養(yǎng) 7 d，檢測細胞增殖及 Notch 基因蛋白表達。將 CD133+與 CD133-MHCC97-H 細胞分別接種于裸鼠背部皮下，4 周后，檢測成瘤情況。
結(jié)果與結(jié)論：①CD133 表達與細胞克隆形成率：CD133+MHCC97-H 細胞 CD133 表達率、克隆形成率均顯著大于 CD133-MHCC97-H 細胞(P < 0.05)；②細胞增殖：CD133+MHCC97-H 細胞培養(yǎng) 3-7 d 的吸光度值大于 CD133-MHCC97-H 細胞(P < 0.05)；③細胞遷移侵襲：CD133+MHCC97-H 細胞遷移與侵襲實驗的透膜細胞數(shù)均顯著多于 CD133-MHCC97-H 細胞(P < 0.05)；④Notch 基因蛋白：CD133+MHCC97-H 細胞 Notch 基因蛋白表達多于 CD133-MHCC97-H 細胞(P < 0.05)；⑤成瘤實驗：CD133-MHCC97-H 細胞組成瘤體積大于CD133-MHCC97-H 細胞組(P < 0.05)；⑥結(jié)果表明：CD133 陽性肝癌細胞亞群具有較強的體外增殖特性，具有一定的腫瘤干細胞特性，并有較強的侵襲、轉(zhuǎn)移及致瘤能力。
關(guān)鍵詞：
干細胞；腫瘤干細胞；肝癌；干細胞表面標志；細胞亞群；細胞增殖；侵襲；轉(zhuǎn)移；干細胞特性；移植瘤；國家自然科學基金
主題詞：干細胞；腫瘤干細胞；細胞增殖；組織工程
基金資助：國家青年科學基金項目(81770221)：膜聯(lián)蛋白 A2 亞硝基化誘導(dǎo)肝細胞癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制

0 引言 Introduction
腫瘤細胞中存在一定的腫瘤干細胞，這是一類特殊的細胞，具有很強的自我更新及分化能力。臨床治療中，腫瘤干細胞的敏感性不強，容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)等情況的出現(xiàn)，影響預(yù)后效果[1]。為此，對腫瘤干細胞相關(guān)生物學特性進行分析，尋找有效的治療靶點至關(guān)重要。肝癌是一種常見的惡性腫瘤，肝癌細胞中也存在一定的腫瘤干細胞[2]。在對腫瘤干細胞進行研究時，人類白細胞分化抗原133(CD133)是一種重要的表面標志物[3]。CD133具有*的信號傳遞通路，可參與到淋巴細胞再循環(huán)過程中，與腫瘤細胞之間存在十分密切的聯(lián)系[4]。以CD133為標志物，利用其蛋白特異性特征可對不同腫瘤干細胞進行分選和研究。此次實驗中，即以CD133為標志物對人肝癌MHCC97-H細胞株進行培養(yǎng)和分選，獲得CD133+/CD133-MHCC97-H細胞，并觀察其遷移侵襲、成瘤能力以及Notch基因蛋白的表達情況
等，以探討干細胞表面標志CD133在肝癌中的表達及其陽性亞群的體外特性。
1 材料和方法 Materials and methods 
1.1 設(shè)計 體外細胞觀察性實驗及隨機對照動物實驗。
1.2 時間及地點 實驗于2015年8至12月在北京大學濱海醫(yī)院實驗室完成。
1.3 材料 人肝癌細胞株MHCC97-H由上海信裕生物技術(shù)有限公司提供；11周齡雄性BALB/c裸鼠10只，體質(zhì)量20-25 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SYXK(京)2013-0058。
主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基、兔抗人Notch單克隆抗體(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(北京智杰方遠科技有限公司)；CD133抗體(澳大利亞，Hyclone公司)；胰蛋白酶(上海素爾生物科技有限公司)；FCR封阻試劑(北京方程生物科技有限公司)；CD133免疫微珠(北京德諾生物科技有限公司)；Giemsa染色液(北京普博斯生物科技有限公司)；MTT(上海滬鼎生物科技有限公司)；細胞裂解液(上海普飛生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜上(上海睿安生物科技有限公司)；Transwell 小室(上海博耀生物科技有限公司)；光學顯微鏡(上海市恒斐生物科技有限公司)；流式細胞儀(上海雷浩信息科技有限公司)；酶標儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。
1.4 實驗方法
1.4.1 肝癌細胞的培養(yǎng) 利用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對人肝癌MHCC97-H細胞株進行常規(guī)培養(yǎng)。觀察細胞生長情況，待細胞大部分長滿后進行傳代培養(yǎng)。去掉培養(yǎng)液，PBS洗滌后添加胰蛋白酶進行消化。收集脫落細胞，添加*培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。收集對數(shù)期細胞，進行后續(xù)實驗。
1.4.2 肝癌細胞中的CD133表達率 對MHCC97-H細胞進行重懸，調(diào)整細胞濃度為1×109 L-1
后，添加CD133抗體進行孵育。30 min后離心，再次重懸，上流式細胞儀進行檢測，記錄細胞CD133表達率。
1.4.3 CD133+/CD133-MHCC97-H細胞分選[5-6] 添加胰蛋白酶對MHCC97-H細胞進行消化，進行細胞重懸，離心后去掉上清，再次進行細胞重懸。添加FCR封阻試劑和CD133免疫微珠，孵育后進行離心和細胞重懸，過柱后分別收集CD133+、CD133-細胞。進行細胞計數(shù)和傳代培養(yǎng)，上流式細胞儀進行檢測，對分選后細胞的CD133表達率進行檢測和記錄。

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