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日期:2019-11-12瀏覽:1444次
免疫熒光技術(shù)有兩種檢測方法:用熒光標(biāo)記抗體示蹤或檢測相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光標(biāo)記抗原示蹤或檢測相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。其中以熒光抗體方法較常用。
1.在開始實(shí)驗(yàn)研究前,有哪些因素需要考慮?
1.根據(jù)抗原選擇合適的抗體:確認(rèn)抗原可以識別哪一種異構(gòu)體以及抗原表位的位置。2. 確認(rèn)您的目的蛋白在該樣本中是否表達(dá)(這里需要用到陽性對照)。3. 根據(jù)您所要研究的目標(biāo)蛋白來確定合適的樣本類型(石蠟切片、冰凍切片還是細(xì)胞制備物等)。4.選擇抗體時需要考慮該抗體的物種交叉反應(yīng);5. 關(guān)于蛋白,您需要考慮它的組織定位和細(xì)胞定位,以及染色時是否應(yīng)該有信號。6.選擇合適的固定方法及抗原修復(fù)方法。7.抗體的工作濃度或稀釋比例,以及抗體的物種來源也是需要考慮的重要因素。
2.免疫組化實(shí)驗(yàn)里為什么要對樣品進(jìn)行處理?
樣品處理是為了調(diào)控樣本中蛋白的表達(dá)水平。如果是細(xì)胞實(shí)驗(yàn),我們可能需要使用適當(dāng)?shù)囊种苿┗蚣せ顒﹣砩险{(diào)或下調(diào)細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)的表達(dá)。如果是體內(nèi)實(shí)驗(yàn),我們需要考慮更多的因素,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)對象是活的實(shí)驗(yàn)動物。在選擇抑制劑或激活劑、激動劑或拮抗劑時,應(yīng)盡量避免由于非特異性結(jié)合其它蛋白所導(dǎo)致的非特異性效應(yīng)。對于某些特殊試驗(yàn)樣品,比如腦,我們需要確保細(xì)胞的滲透性,讓化合物能真正進(jìn)入細(xì)胞或血腦屏障。另外需要確保所使用的化學(xué)品能夠溶于合適的溶劑。還有確定*適合的給藥途徑(注射或口服)。完成上述所有步驟之后,您就可以獲取組織或細(xì)胞樣品了。
3.請問如何根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對象來選擇不同的樣本形式呢?
對于細(xì)胞制備物,它們常見的形式是涂片或培養(yǎng)的細(xì)胞系。對于組織樣本,*常用的是石蠟包埋的組織切片,福爾馬林固定。原因是它們能夠保持組織形態(tài)與蛋白抗原性之間的*佳平衡。石蠟包埋的組織切片很穩(wěn)定,并且易于使用。但它的不足之處是很耗時(需要對切片進(jìn)行脫蠟處理和抗原修復(fù))。一般來說,石蠟切片適用于 4 微米厚的切片。如果切片厚度大于4微米,抗體可能會被困住,導(dǎo)致假陽性染色,這是我們需要避免的。
另一種常見的樣本形式是冰凍組織切片(IHC-FR),這對于不能經(jīng)受醛固定處理和石蠟處理的抗原來說非常理想。因此這些抗原將呈現(xiàn)出更天然的狀態(tài)。但冰凍切片的缺點(diǎn)是組織形態(tài)可能不佳,與石蠟切片相比,冰凍切片可能沒那么好看。冷凍切片通常也僅適用于厚度為 4 到 10 微米的薄切片,超過這個厚度的切片可能會困住抗原,導(dǎo)致假陽性染色結(jié)果。如果您所要研究的組織類型無法做成這種厚度的薄切片,可以考慮采用漂片。該技術(shù)一般用于腦組織和脊髓,在發(fā)育研究中,這是一項(xiàng)非常有用的技術(shù)。該技術(shù)可用于厚度達(dá) 40 微米的更大切片。它的缺點(diǎn)是操作起來更加不便,整個過程中組織樣品都處于自由漂浮狀態(tài),*后還必須將它們固定在載玻片上進(jìn)行觀察,操作有一定的難度。它的另一個缺點(diǎn)就是非常耗時,尤其是應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究時,動物用 BFA 灌注,這顯然也是有難度的一步。