【預(yù)期用途】

僅供科研使用，本試劑盒用于測(cè)定小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中高密度脂蛋白(HDL)含量。

【檢測(cè)原理】

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠高密度脂蛋白(HDL)水平。用純化的小鼠高密度脂蛋白(HDL)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入高密度脂蛋白(HDL)，再與HRP標(biāo)記的高密度脂蛋白(HDL)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的高密度脂蛋白(HDL)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠高密度脂蛋白(HDL)濃度。

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

120μmol/L 5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

60μmol/L 4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

30μmol/L 3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

15μmol/L 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

7.5μmol/L 1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

8.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10-20分鐘。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意：

1.試劑準(zhǔn)備：試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用。準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說(shuō)明書要求保存，以備下次使用。

2.加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的滅菌吸頭，避免污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡產(chǎn)生，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。與反應(yīng)試劑加入一樣，加樣過(guò)程中第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣時(shí)間間隔盡量小（一般控制在10 分鐘以內(nèi)），如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育"時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。為了測(cè)值的準(zhǔn)確性，推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4.洗滌：濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。充分洗滌非常重要，在每次洗滌過(guò)程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔內(nèi)殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果使用自動(dòng)洗板機(jī)，請(qǐng)?jiān)谑炀毷褂煤笤儆糜谡綄?shí)驗(yàn)過(guò)程中。

5.反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化，如觀察到顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6.底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

【結(jié)果計(jì)算】

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。