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日期:2023-05-31瀏覽:476次
酶免疫測定自20世紀(jì)70年代初創(chuàng)立以來,由于其具有特異、靈敏、簡便、快速的特點,現(xiàn)已在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域及臨床疾病的診療中得到了廣泛的應(yīng)用,相對于放射免疫測定(RIA)技術(shù)來說,EIA還有試劑半衰期長,對環(huán)境污染小,試驗廢物易于處理等優(yōu)點,但測定敏感性一般較RIA低,于是,為提高EIA的測定敏感性,出現(xiàn)了眾多的EIA測定放大系統(tǒng),使EIA的測定敏感性趕上甚或超過了RIA。
建立正IA測定放大系統(tǒng)的一般原則
EIA本身是以酶[辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)等]作標(biāo)記物的,因此,EIA的測定放大始終是圍繞著標(biāo)記酶來作文章的,不外乎三種可能的方式:①增加標(biāo)記酶的量;②非顯色底物的應(yīng)用;③附加一個受標(biāo)記酶催化的反應(yīng)系統(tǒng)。
一、增加標(biāo)記酶的量
通過生物素/親合素—酶或酶/抗酶復(fù)合物的間接方法,可以增加ELISA測定中最后所測定的標(biāo)記酶的量。這種方法雖在一定程度上由于標(biāo)記酶的聚集增加了EIA的測定敏感性,但同時有增加非特異的背景顯色的可能。
二、非顯色底物的應(yīng)用
從酶的反應(yīng)底物著手,使用具有高測定敏感性的非顯色底物如熒光素或發(fā)光物,從而提高EIA的測定敏感性,這種方法的優(yōu)點是不需額外的步驟及試劑制備,缺點是需要特殊的測定儀器。
三、附加一個受標(biāo)記酶催化的反應(yīng)系統(tǒng)
原始標(biāo)記酶催化附加一個反應(yīng)系統(tǒng),如酶底物反應(yīng)循環(huán)或酶級聯(lián)反應(yīng),從而達(dá)到反應(yīng)放大的目的。這種由數(shù)個催化反應(yīng)的耦聯(lián)而構(gòu)建的放大系統(tǒng),是酶放大的根本之所在,敏感性的提高來源于真正的信號放大,而不是簡單地將一個分子轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗟囊子跍y定的分子。一個適用的酶放大系統(tǒng)的選擇除了要考慮生化因素外,最為重要的是酶及其底物的穩(wěn)定性,并要易于獲得,因其對試驗的準(zhǔn)確性和重復(fù)性有較大的影響。