血細(xì)胞分析儀是醫(yī)院臨床檢驗(yàn)應(yīng)用非常廣泛的儀器之一，是指對一定體積內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量及異質(zhì)性進(jìn)行分析的儀器。隨著電子技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)和新熒光化學(xué)物質(zhì)等各種高新技術(shù)在血細(xì)胞分析儀中的應(yīng)用，使血細(xì)胞分析儀的檢測原理不斷完善、測量參數(shù)不斷增加、檢測水平不斷提高，尤其在白細(xì)胞五分類技術(shù)方面，已發(fā)展到可利用多項(xiàng)技術(shù)聯(lián)合(如射頻、細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)和熒光染色技術(shù)等)，同時(shí)檢測一個(gè)白細(xì)胞再用先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)區(qū)分、辨別，經(jīng)上述方法處理后的各自細(xì)胞間的細(xì)胞差別。綜合分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出較為準(zhǔn)確的白細(xì)胞分類結(jié)果，為臨床疾病的診斷、治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。近年來，可以對白細(xì)胞進(jìn)行五分類計(jì)數(shù)的血細(xì)胞分析儀已經(jīng)普遍使用。下面就為大家介紹目前血細(xì)胞五分類測定中常用技術(shù)及技術(shù)原理。

血細(xì)胞五分類技術(shù)的原理

1. 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)

流式細(xì)胞術(shù)是一種綜合應(yīng)用光學(xué)、機(jī)械學(xué)、流體力學(xué)、電子計(jì)算機(jī)、細(xì)胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù)，使被測溶液流經(jīng)測量區(qū)域，并逐一檢測其中每一個(gè)細(xì)胞的物理和化學(xué)特性，從而對高速流動的細(xì)胞或亞細(xì)胞進(jìn)行快速定量測定和分析的方法。

①.待測細(xì)胞經(jīng)處理或染色后被壓入流動室，與此同時(shí)，不含細(xì)胞的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣鞘液就能被包繞著樣品高速流動，組成一個(gè)圓形的流束，待測細(xì)胞在包繞下單行排列，依次通過檢測區(qū)域，在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，這兩個(gè)光源信號分別反映了細(xì)胞體積的大小和內(nèi)部的信息，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模，數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識別的數(shù)字信號，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，可將分析結(jié)果顯示在屏幕上。

②.為了保證細(xì)胞單個(gè)排列地逐一通過檢測區(qū)域，鞘流技術(shù)在流式細(xì)胞術(shù)中被廣泛應(yīng)用。根據(jù)層流理論，由于兩種液體的流速和壓力不同，所以在一定條件下樣品溶液與包裹它的鞘液在流動中可以保持相互分離并且同軸。同時(shí)鞘液流可以加速樣品溶液中顆粒的流動并迫使他們的流動軌跡保持在液流的中軸線上，使細(xì)胞單排列地逐一通過檢測區(qū)域，這便是所謂的液流聚焦原理

2. 阻抗法

根據(jù)庫爾特原理，將不良導(dǎo)體血液按一定比例稀釋于等滲的電解液中，在小孔電極的兩側(cè)加一恒流源在負(fù)壓作用下，使稀釋的血細(xì)胞通過小孔，當(dāng)細(xì)胞通過截面時(shí)會由于電阻增大產(chǎn)生相應(yīng)的脈沖，其脈沖的幅度與細(xì)胞的體積成正比，脈沖的頻度與細(xì)胞的數(shù)量成正比。利用庫爾特原理可以有效地區(qū)分淋巴及單核細(xì)胞。

3. 激光散射法／多角度偏振光散射技術(shù)

①.根據(jù)光散射理論，當(dāng)激光照射到流動室內(nèi)流過的每一個(gè)細(xì)胞時(shí)，由于細(xì)胞的物理特性，部分光線從細(xì)胞上經(jīng)不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞體積；大角度散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞核，漿復(fù)雜度和細(xì)胞顆粒的信息；而側(cè)向散射光的光強(qiáng)可以反應(yīng)細(xì)胞膜、核膜、細(xì)胞質(zhì)的變化。因此，可以依據(jù)細(xì)胞表明光散射的特點(diǎn)對細(xì)胞進(jìn)行分類。用激光光源產(chǎn)生的單色光束直接進(jìn)入計(jì)數(shù)池的敏感區(qū)，在不同角度(10度~70度)對每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行掃描分析，測定其散射光強(qiáng)度，從而提供細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)的光散射信息。由于粗顆粒細(xì)胞的散射強(qiáng)度比細(xì)顆粒細(xì)胞更強(qiáng)，故光散射對細(xì)胞顆粒的構(gòu)型和顆粒質(zhì)量具有很好的區(qū)別能力。

②.多角度偏振散射技術(shù)用偏振激光束射照單個(gè)排列細(xì)胞，并進(jìn)一步分辨細(xì)胞。該技術(shù)采用了10度窄角和偏振加消偏振檢測法，分辨能力有所提高。它首先測試中性，單核細(xì)胞，用0度～90度的散射數(shù)據(jù)，再測得90度的衍射差，將嗜酸性和中性細(xì)胞分開，而嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞則按其大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同的復(fù)雜性，所產(chǎn)生的散射光也各異，用可調(diào)較的門限加以區(qū)分。其采用特定程序自動儲存分析數(shù)據(jù)，并經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理，在屏幕上顯示6個(gè)散點(diǎn)圖和2個(gè)直方圖。

4. 各種細(xì)胞化學(xué)特性應(yīng)用技術(shù)

利用五種白細(xì)胞自身不同的化學(xué)性質(zhì)，應(yīng)用相應(yīng)的化學(xué)試劑加以區(qū)分，由于嗜酸性(或嗜堿性)粒細(xì)胞均有較強(qiáng)的堿性(酸性)，因此在特殊的溶血?jiǎng)┳饔孟拢?jīng)過特定時(shí)間及溫度的孵育，可使除嗜酸性(嗜堿性)粒細(xì)胞之外的所有細(xì)胞溶解或wei縮，經(jīng)處理之后的細(xì)胞根據(jù)阻抗脈沖計(jì)數(shù)法，可得相應(yīng)嗜酸性(嗜堿性)細(xì)胞有效數(shù)值。

利用五種白細(xì)胞過氧化物酶活性的差異對白細(xì)胞進(jìn)行染色，測定其酶反應(yīng)強(qiáng)度，對白細(xì)胞進(jìn)行分析。血液中五種白細(xì)胞的過氧化物酶活性排列順序?yàn)椋菏人嵝粤＜?xì)胞>中性粒細(xì)胞>單核細(xì)胞。淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞均無過氧化物酶。將待測血液加入清洗劑和甲醛的等滲液體內(nèi)經(jīng)孵育，再加入過氧化氫和四氯一萘酚，細(xì)胞內(nèi)過氧化酶分解產(chǎn)生氧離子，使四氯一萘酚顯色并沉淀，并定位于酶反應(yīng)部位。根據(jù)酶反應(yīng)強(qiáng)度的不同，利用光電檢測技術(shù)測定相應(yīng)吸光度值的方法,用以區(qū)分嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。

5. 熒光法

利用不同細(xì)胞的細(xì)胞膜、胞內(nèi)因子以及胞內(nèi)DNA、RNA、胞內(nèi)離子鈣等不同染色特性，選用具有特異性抗原或抗體的熒光染料載體，使待分離的細(xì)胞分別標(biāo)記相應(yīng)的熒光物質(zhì)，經(jīng)過特定波長的激光照射激發(fā)出不同波長的熒光，利用各種PMT管檢測熒光信號的個(gè)數(shù)，可以完成待檢細(xì)胞的計(jì)數(shù)，如進(jìn)一步分析計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞等。

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