考馬氏亮藍(lán)G－250染色法使用方法

【操作步驟】
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
按下表操作，在試管中分別加入0、20、40、80、100微克蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水補(bǔ)足到100微升，加入3ml的染色液，混勻后室溫放置15分鐘。

在595nm波長(zhǎng)比色，讀出吸光度，以各管的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、血清蛋白質(zhì)測(cè)定
稀釋血清（或其它蛋白樣品溶液），準(zhǔn)確吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度（此為稀釋500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只試管，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按下表操作。混勻后室溫放置15分鐘，在595nm波長(zhǎng)比色，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

【原 理】
考馬氏亮藍(lán)G－250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當(dāng)它通過(guò)疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍(lán)色，zui大吸收波長(zhǎng)從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與 595nm的吸光度成正比，測(cè)定595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。
【注意事項(xiàng)】
1、常用試劑的干擾：有些常用試劑在測(cè)定中會(huì)受到不同程度的干擾。Tris、巰基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢劑有較少影響，而1％SDS、1％ TritonX-100及1％Hemosol的干擾嚴(yán)重。
2、顯色結(jié)果受時(shí)間與溫度影響較大，須注意保證樣品與標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定控制在同一條件下進(jìn)行。
3、考馬氏亮藍(lán)G－250染色能力很強(qiáng)，特別要注意比色杯的清洗。顏色的吸附對(duì)本次測(cè)定影響很大?？蓪y(cè)量杯在0.1mol/L HCl中浸泡數(shù)小時(shí)，再?zèng)_洗干凈即可。

【試 劑】
1、考馬氏亮藍(lán)G－250染色液：
稱(chēng)取100mg考馬氏亮藍(lán)G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100 毫升85％的磷酸，加入稀釋到1升。
2、蛋白標(biāo)準(zhǔn)（0.1mg/ml）
準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理鹽水至刻度，溶后分裝，－20℃冰箱保存。
【計(jì) 算】
每100毫升血清中蛋白質(zhì)的含量（g％）

此方法是1976年Bradform建立。染料結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可檢測(cè)到微量蛋白，操作簡(jiǎn)便、快迅，試劑配制極簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，但干擾因素多。