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ATCC細(xì)胞冷凍?又如何解凍?

日期:2014-01-10瀏覽:770次

    時間過的可真快呀,一月份都已經(jīng)過去三分之一啦,等待春節(jié)的到來,真是激動人心的,元旦剛過,就是臘八節(jié)了,我公司還開展了臘八*一周的*活動哦!想了解的朋友們可以。

    在昨天下午的時候,我公司接到了一個咨詢有關(guān)細(xì)胞冷凍的朋友來電,我公司很快地到了技術(shù)部人員為這位朋友解決了問題。細(xì)胞也為我公司主營產(chǎn)品之一,我公司王提出應(yīng)將ATCC細(xì)胞冷凍及解凍方法發(fā)布出來分享給其他的朋友們。

ATCC細(xì)胞冷凍?又如何解凍?

細(xì)胞冷凍及保存 
材料:
    生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO、無菌塑料冷凍保存管、0.4%(w/v)trypan blue、血球計數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(jī)。

冷凍保存方法:
1、傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 
2、程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。

步驟:
1、冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長情形。
2、配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中,zui后濃度為5~10%,混合均勻,置于室溫下待用。
3、依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
4、離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細(xì)胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中,1ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。

朋友們可要注意嘍:
1、欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),約為80–90%致密度。
2、冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
3、注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級,無菌且無色(以0.22micron FGLP flon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。 

ATCC細(xì)胞
冷凍保存之細(xì)胞濃度:
1、normal
human fibroblast:1~3×106cells/ml
2、hybridoma:1~3×106cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。
3、adherent tumor 
lines:5~7×106,依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
4、other
suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
5、冷凍保護(hù)劑濃度為5或10%DMSO,若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應(yīng)作一個backup culture,以防止冷凍失敗。 

冷凍細(xì)胞活化 
1、冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害,導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。
2、細(xì)胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代,其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
材料:37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器 。
步驟:
1、操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。
2、自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程,此時蓋子易松掉。
3、將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,回溫后噴以70%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內(nèi)。
4、取出冷凍管,立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內(nèi)。
5、取出解凍之細(xì)胞懸浮液,緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10~1:15),混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。
6、解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO或glycerol),依細(xì)胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除,則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),離心1000rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
7、若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

    只要是我公司的客戶,工作時間內(nèi)提供免費(fèi)的技術(shù)咨詢和指導(dǎo)。歡迎朋友們我公司產(chǎn)品哦!

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