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日期:2015-09-01瀏覽:2914次
酶聯(lián)免疫斑點法是ELISA方法中的一種,目前國內很少客戶用這種方法檢測,一般都是用的雙抗體夾心法及間接法,酶聯(lián)免疫斑點法國內很少客戶用這種方法檢測,但是我們也該清楚他們的操作步驟,下面讓我們一起來看看我司錢為客戶準備的酶聯(lián)免疫斑點法操作步驟:
1.用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板,室溫下孵育10分鐘。
2.倒去酒精,用100ul PBS洗滌3次。
3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中,混合,每孔加100ul,蓋上板蓋。
4. 倒去液體,100ul PBS洗滌一次。
5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS(見試劑準備),蓋上板蓋,室溫下孵育2小時。
6.在水槽邊和吸水紙上輕打,倒去液體。
7.用100ul PBS洗滌一次。
8.每孔加入100ul細胞懸浮液(含適當量的細胞和相應濃度的刺激劑)。細胞可預先在體外接受刺激(間接Eli-spot)。蓋上標準的 96孔板塑料板蓋,37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時間(15-20小時)。這期間不要晃動或移動孔板。
9.在水槽邊和吸水紙上輕打,倒去液體。
10.每孔加100ul洗滌緩沖液,4℃孵育10分鐘。
11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體,此為一板的量。每孔加100ul此液體,蓋上板蓋,37℃下孵育1小時30 分。
13.倒去液體,用100ul洗滌緩沖液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體,蓋上板蓋,37℃孵育1小時。
15.倒去液體,用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打,吸干殘留的洗滌液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室溫下反應5-15分鐘。*顯色后,將此液倒于相應的盤中。
18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍,使膜干燥。保存時,將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后,讀取點數(shù)。4℃下放置一 夜,點會比較明顯。此板在室溫下避光保存。